上海研域生物原代細胞凍存和復(fù)蘇?檢測方法包括以下步驟

我們知道，在原代細胞培養(yǎng)檢測實驗在實驗儀器等工作上都要耗費不少的人力和體力。好在很久以前就有高人發(fā)明了原代細胞保存這個實驗步驟，將暫時多出來的原代細胞冰凍保存，保存細胞活力。

原代細胞復(fù)蘇是一個簡單的試驗操作，但操作中也有許多需要注意的事項，在實驗操作中注意細小的問題，才能使復(fù)蘇后的細胞保持良好的狀態(tài)，針對原代細胞復(fù)蘇應(yīng)該注意以下幾點：

1. 可以提前把需要的體積的培養(yǎng)液放到培養(yǎng)瓶里，擰松瓶蓋，放到孵箱里30分鐘--1個小時； 

2. 為防止凍存管在升溫時出現(xiàn)爆裂等情況，可以在放入水浴前就把超凈臺里的蓋子擰松一下然后再擰上；

3. 水浴溫度37℃左右。

一、慢凍程序

1.  標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細胞凍存器

當(dāng)溫度在-25 ℃以上時，1~2 ℃/min；

當(dāng)溫度達-25 ℃以下時，5~10 ℃/min；

當(dāng)溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中。

2.  簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜，次日早晨投人液氮中。

3.  傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽長期儲存。

二、低溫保護劑的應(yīng)用

在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。

常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。

三、保存細胞的復(fù)蘇方法

1.  快速解凍

凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）。

2.  解凍后的細胞可直接接種到生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。

3.  如果細胞對冷凍保護劑特別敏感

解凍后的原代細胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。

上海研域生物應(yīng)保證清潔，整個操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸，并可以使實驗中用到的“花板"降至限度。從而提高檢測的特異性，并得到更準(zhǔn)確、可靠的實驗結(jié)果。